بلاتینگ BLOTTING

در ژنتیک مولکولی به انتقال مولکول‌های تفکیک شده براساس اندازه مولکولی در الکتروفورز از ژل به روی یک غشا ویژه، بلاتینگ یا بلات کردن گفته می‌شود که موجب تثبیت مولکول مورد نظر بر روی یک بستر که معمولا یک غشای نیتروسلولزی است، می‌شود. جنس غشا می‌تواند نیترو سلولز یا پلی وینیلیدن فلوراید و… باشد و انتقال مولکول‌ها از طریق اثر مویینگی به غشا صورت می گیرد. بر روی ژل نمی‌توان به خوبی هیبریداسیون اسیدهای نوکلئیک و شناسایی پروتئین‌ها را انجام داد، زیرا ژل‌ها نفوذپذیری کمی دارند و شناساگرها (Probe) به راحتی از ژل خارج می‌شوند، همچنین ماتریکس ژل باعث هیبریداسیون‌های نادرست فراوانی می‌شود که سیگنال‌های مربوط به هیبریداسیون‌های اختصاصی را پوشش می‌دهند، به همین دلیل برای هیبریداسیون و تفکیک مولکول‌ها از غشا استفاده می‌شود که محیطی با آلودگی کمتر به منظور انجام دقیق‌تر واکنش‌های هیبریداسیون فراهم می نماید.

تکنیک ساترن بلاتینگ

این تکنیک ژنتیک مولکولی، برای نخستین بار توسط دانشمند زیست- شیمی اهل انگلستان به نام Edwin Southern در سال ۱۹۷۵ معرفی شد. هدف از انجام آن، تشخیص توالی‌های خاص DNA در نمونه‌های زیستی مورد استفاده می باشد. توالی‌های هدف می‌توانند جزئی از خانواده ژ‌ن‌های مرتبط با یکدیگر از لحاظ تکاملی، توالی‌های DNA موجود در داخل یک ژنوم و یا دقیقا معادلی برای پروبی در داخل ژنومی دیگر ‌باشند. در مورد آخر، ژنوم‌ها می‌توانند از افراد مختلف یک گونه و یا از گونه‌های متفاوتی تهیه شوند. همچنین، از این تکنیک می‌توان برای ردیابی یک ژن خاص در کل ژنوم و تشخیص واریانت‌های ژنتیکی استفاده کرد. در ساترن ‌بلات، قطعات DNA باید برای انجام هیبریداسیون دناتوره (تک رشته ای) بشوند، بنابراین زمانی که قطعات DNA تک رشته‌ای به غشا منتقل می‌شوند، می‌توانند با پروب هیبرید شوند. DNA تک‌رشته‌ای در غشا در معرض پروب‌های نشان‌دار ‌شده قرار می‌گیرد و در صورت مکمل بودن پروب با هر یک از قطعات DNA تک رشته‌ای، هیبرید تشکیل میشود و پروب در محل‌های قطعات مکمل به غشا متصل می‌شود. وجود هیبریداسیون‌ها با ردیابی پروب‌های نشان‌دار روی غشاها توسط تکنیک X-ray قابل شناسایی است.

مراحل انجام ساترن بلات

• در مرحله اول، DNA با استفاده از آنزیم‌های اندونوکلئاز محدود کننده به قطعات کوچک شکسته می‌شوند.
• سپس این قطعات بر روی ژل جداکننده الکتروفورز قرار داده می‌شوند تا با توجه به اندازه آن‌ها از یکدیگر جدا شوند. اگر قطعات DNA از نظر اندازه بسیار بزرگ باشند (بزرگتر از ۱۵ کیلوباز)، امکان انتقال رشته‌های DNA به صورت دقیق‌ از ژل به غشا وجود ندارد و باید ابتدا ژل با هیدروکلراید تیمار گردد تا قطعات DNA به قطعات کوچک‌تر تقسیم شوند.
• بعد از جدا شدن قطعات DNA بر روی ژل، یک ورقه نیتروسلولوز به عنوان غشا روی ژل جداکننده قرار داده می‌شود و با اعمال فشار بر روی غشا و ژل، یا با استفاده از مواد بازی دناتوره یا انکوباسیون ژل در اسید قوی، تعامل مناسبی بین این دو ایجاد شده و DNA از ژل به یک غشای نیتروسلولزی یا نایلون منتقل می شود. انتقال مولکول‌های DNA تک‌رشته‌ای به غشا توسط capillary action صورت می‌گیرد. مولکول‌های DNA پس از انتقال به غشا نیز تک‌رشته‌ای می‌مانند.
• پس از آن غشا در معرض پرتوهای فرابنفش قرار می‌گیرد یا در خلا یا آون با دمای ۸۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲ساعت حرارت داده می‌شود تا قطعات روی غشا ثابت شوند.
• سپس غشا همراه با پروب‌های کوتاه، تک‌رشته‌ای و لیبل‌شده انکوبه می شود. انکوباسیون در دمایی انجام می‌گیرد که باعث هیبریداسیون مولکول‌های DNA به صورت اختصاصی و با کمترین میزان mismatch شود. بسته به میزان موردانتظار از قرابت توالی پروب و هدف، دما و درنتیجه میزان mismatch قابل تحمل، می‌تواند تغییر کند. در دماهای بالا، پروب تقریبا به توالی‌های کاملا منطبق متصل خواهد شد. این در حالی است که در دماهای پایین، پروب ممکن است به جایگاه‌هایی با چندین mismatch اتصال یابد.
• پس از فرآیند هیبریداسیون، پروب‌های اضافی با استفاده از بافر SSC از بین می‌روند و تمام اتصالات غیراختصاصی پس از شست‌ وشوی پایه از هم گسسته خواهند شد.
• لیبل کردن مولکول‌های پروب می‌تواند با استفاده از مواد رادیواکتیو مانند ۳۲P، و یا بیوتین و دیگوکسی‌ژنین انجام بگیرد. در صورتی که پروب رادیواکتیو باشد، از فیلم عکاسی استفاده می‌شود. در صورتیکه پروب با بیوتین و یا دیگوکسی‌ژنین لیبل شود، غشا ابتدا باید تحت تاثیر سوبسترای chemiluminescent قرار بگیرد تا هیبریدهای تشکیل شده بین پروب و مولکول هدف مشخص شوند و سپس آن را در معرض فیلم عکاسی قرار دهیم. این روش‌های غیررادیواکتیو، ایمن‌تر و سریع‌تر می‌باشند. البته لیبل‌های بیوتین یا دیگوکسی‌ژنین می‌توانند با قرار گرفتن تحت تاثیر مواد کروموژن نیز مشاهده شوند.

کاربردهای روش ساترن بلات

• برای شناسایی DNA در نمونه‌ها
• انگشت نگاری DNA (DNA finger printing)
• کاربرد در پزشکی قانونی، آزمایش تعیین والدین، شناسایی مجرم
• برای جداسازی و شناسایی ژن‌های مورد نظر در نمونه
• در پلی مورفیسم قطعه محدودکننده یا تکنیک RFLP
• برای شناسایی جهش یا تنظیمات ژن در توالی DNA
• در تشخیص بیماری ناشی از نقایص ژنتیکی، مانند بیماری‌های تکرار سه‌تایی (trinucleotide repeat diseases)
• برای شناسایی عوامل عفونی